表达宿主的选择如何决定单元操作要求？比较大肠杆菌（E. coli）与哺乳动物细胞

表达宿主决定了工艺流程。 选择大肠杆菌还是哺乳动物细胞会影响生物反应器控制、收获策略、杂质去除、纯化复杂性以及设施要求。大肠杆菌通常能实现快速、高密度的发酵，但可能需要进行细胞破碎、包涵体回收、复性以及内毒素清除；哺乳动物细胞通常需要更温和的培养和收获方式，但能够将正确折叠且经过糖基化的蛋白质分泌到培养基中。

宿主选择是一项上游决策，会对下游产生影响。 宿主的生长行为、蛋白质定位、折叠能力、翻译后修饰以及杂质谱决定了需要哪些单元操作以及这些操作的难度。

为什么宿主选择决定了工艺

宿主决定蛋白质质量

大肠杆菌对于许多相对简单的重组蛋白非常有效，因为它生长迅速且易于基因操作。然而，它无法重现许多真核生物的翻译后修饰，包括某些治疗性蛋白质所需的复杂糖基化模式。

哺乳动物细胞（特别是CHO细胞）能够生产出折叠和糖基化更适合多种人类治疗药物的蛋白质。这种能力伴随着生长速度较慢、对环境变化更敏感以及更严苛的培养控制要求。

宿主决定产品位置

在大肠杆菌中，重组蛋白可能保留在细胞质内或以不溶性包涵体的形式积累。因此，回收过程始于生物质处理，而不是简单的培养液澄清。

哺乳动物细胞通常将重组产品分泌到培养基中。这使得工艺可以从去除细胞和细胞碎片开始，避免了许多细菌产品所需的机械破碎和包涵体增溶步骤。

宿主决定杂质谱

细菌工艺必须解决宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、细胞壁成分和内毒素等杂质。内毒素是肠外给药治疗药物的一个特别重要的关注点，因为它可能引发严重的炎症反应。

相比之下，哺乳动物工艺必须控制宿主细胞蛋白、残留DNA、病毒、聚集体和产品相关变体等杂质。因此，病毒安全性和清除成为下游设计的核心部分。

大肠杆菌如何改变单元操作

发酵偏向高速率操作

大肠杆菌可以实现快速生长和高体积生产率。上游工艺通常使用受控的补料分批发酵，并仔细管理营养补料、温度、溶解氧、pH值、搅拌和除热。

高耗氧量和快速代谢会产生显著的热量和氧传递负荷。因此，生物反应器及其控制系统必须支持强力混合和高效气体传递，同时避免促进过量乙酸形成或产品降解的条件。

收获需要生物质回收

由于产品通常位于细胞内，第一个下游步骤通常是细菌生物质的分离和收集。离心法是常用的方法，尽管在特定规模下，过滤或其他固液分离方法也可能适用。

所需的设备必须能够处理浓缩的细胞悬浮液，并在破碎前提供可靠的回收。这使得收获操作在本质上不同于分泌型产品工艺。

细胞破碎变得至关重要

通常需要高压匀质或其他机械破碎方法来释放胞内蛋白。该操作必须在充分裂解与防止过热、起泡和蛋白质降解之间取得平衡。

破碎后，通过离心或深层过滤去除细胞碎片和不溶性物质。如果目标蛋白存在于包涵体中，则可能需要特意保留不溶性部分而不是将其丢弃。

包涵体增加了回收序列

包涵体处理可能需要分离、洗涤、化学增溶和复性。可以使用尿素或盐酸胍等变性剂来增溶蛋白质，随后通过仔细控制的稀释或缓冲液置换来尝试恢复其天然结构。

复性通常是最难放大的操作之一。它可能需要巨大的容器体积、延长的处理时间、大量的缓冲液和变性剂消耗，以及用于去除错误折叠或聚集蛋白质的额外步骤。

纯化必须解决内毒素

即使产品成功复性，工艺也必须将内毒素和其他细菌杂质去除到规定水平。根据分子特性和监管要求，可以结合使用层析、过滤、基于相的方法或这些方法的组合。

因此，纯化流程既受产品化学性质的影响，也受细菌来源的影响。高表达水平并不自动转化为高最终收率。

哺乳动物细胞如何改变单元操作

生物反应器需要低剪切操作

哺乳动物细胞比细菌更脆弱，对过度搅拌、通气和机械应力敏感。因此，生物反应器采用在限制剪切暴露的同时保持均匀性的混合和气体传递策略。

溶解氧、pH值、温度、渗透压和二氧化碳必须控制在相对狭窄的操作范围内。该工艺还可能需要专门的叶轮、喷射器和氧传递方法。

培养基和补料要求更高

哺乳动物细胞培养通常生长较慢，需要精心配制的培养基。补料分批操作很常见，营养添加旨在维持活细胞密度和产品形成，同时限制抑制性代谢产物的产生。

与细菌发酵相比，这意味着更长的培养周期以及对污染或控制故障更高的敏感性。设施调度和培养基制备能力成为重要的设计考量。

收获从澄清开始

当蛋白质被分泌时，下游处理始于从培养液中去除完整细胞和细胞碎片。通常使用深层过滤、离心、微滤或这些操作的组合。

澄清系统还必须应对工艺特有的挑战，如高细胞密度、粘度以及随着细胞老化或裂解而释放的宿主细胞杂质。过滤器的容量和污堵行为会强烈影响放大过程。

纯化可以更直接

分泌型、正确折叠的产品避免了破碎、包涵体分离、增溶和复性的序列。澄清后的收获液可以通过捕获层析，随后进行精制、病毒灭活或清除以及最终过滤（视情况而定）。

这并不意味着哺乳动物细胞的纯化很简单。产品可能仍需要多个层析步骤、聚集体去除、严格的病毒清除以及对宿主细胞蛋白和DNA的控制。

病毒安全性成为决定性要求

哺乳动物细胞工艺需要一套有据可查的病毒安全策略。这可能包括合格的原材料、细胞库表征、工艺控制、专门的病毒清除步骤以及经过验证的过滤或灭活操作。

这些要求影响设备选择、设施隔离、验证工作和整体工艺控制策略。它们是细菌和哺乳动物制造之间操作差异的主要部分。

宿主选择如何影响设施和设备设计

上游设备遵循细胞敏感性

大肠杆菌工艺通常强调氧传递、除热、高速补料和强力混合。哺乳动物工艺强调低剪切流体处理、稳定的环境控制、长培养周期和可靠的无菌操作。

这些差异影响了叶轮选择、通气、传感器配置、控制回路性能以及一次性或不锈钢设备的选择。

下游设备遵循产品位置

胞内细菌产品需要用于生物质浓缩、破碎、固体分离以及通常涉及复性的设备。分泌型哺乳动物产品需要针对大体积澄清、层析、病毒清除和无菌过滤优化的设备。

因此，相同的名义生产规模可能需要截然不同的容器尺寸、过滤面积、缓冲液容量和层析配置。

放大标准是宿主特异性的

对于大肠杆菌，放大可能受到氧传递能力、混合时间、除热能力以及处理浓缩生物质能力的限制。对于哺乳动物细胞，活细胞保留、气体传递性能、剪切暴露和长期培养稳定性通常更为重要。

仅通过增加容器体积无法可靠地放大工艺。必须在各规模下保持相关的生物学和工程约束。

理解权衡

高表达不等于高收率

大肠杆菌可以提供高体积生产率，但大部分产品可能是不溶的或难以回收。在破碎、增溶、复性、聚集体去除和内毒素清除过程中的损失会显著降低最终收率。

哺乳动物细胞每单位体积产生的产品可能较少，或需要更长的生产周期，但回收的蛋白质可能更接近其活性的最终形式。最终产品收率和质量比单纯的表达水平更有意义。

更简单的生物学可能导致更难的纯化

细菌系统在基因上易于操作，且培养成本相对较低。然而，它们缺乏真核生物加工能力以及倾向于胞内积累的特性，可能会将复杂性转移到下游操作中。

哺乳动物系统施加了更严苛的培养条件和污染控制要求。它们分泌复杂蛋白质的能力可以降低回收的复杂性，但病毒安全性和产品变体控制仍然是重要的要求。

固定的工艺比较可能会产生误导

声称某种宿主总是需要特定数量的单元操作或提供通用收率的说法是不可靠的。实际性能取决于蛋白质、表达构建体、培养模式、产品位置、杂质负担和纯化化学。

说明性的比较可以显示权衡的方向，但工艺决策应依赖于分子特异性的开发数据，而不是通用的步骤计数或收率百分比。

错误的宿主会造成可避免的成本

为需要哺乳动物糖基化的蛋白质选择大肠杆菌可能会产生大量但无活性或临床上不适用的产品。为简单的非糖基化蛋白质选择哺乳动物细胞可能会导致不必要的培养时间、设施复杂性和成本。

因此，宿主选择应针对目标产品概况进行，而不仅仅是针对最快的生长速度或实验室最高的表达水平。

为您的目标做出正确的选择

合适的宿主是在满足所需质量属性的同时，使总工艺难度最小化的宿主。

• 如果您的主要重点是快速、经济地生产相对简单的蛋白质： 大肠杆菌可能是合适的，前提是工艺能够处理胞内回收、包涵体、复性和内毒素。
• 如果您的主要重点是天然折叠或复杂糖基化： 哺乳动物宿主通常是更强的选择，其工艺从一开始就设计了低剪切培养和病毒安全操作。
• 如果您的主要重点是下游简单性： 选择能够分泌稳定、正确折叠产品的宿主，同时考虑澄清、层析、聚集体控制和病毒清除要求。
• 如果您的主要重点是中试工厂或工艺开发的灵活性： 围绕可互换的宿主特异性单元操作配置设施，包括用于细菌系统的高压破碎，以及用于哺乳动物培养的温和澄清和过滤。

最好的表达宿主不是初始表达量最高的宿主，而是能够以可放大、可控制且经济上合理的方式生产所需分子的宿主。

总结表：

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