要抑制 Crabtree 效应，应将酵母工艺作为受控补料分批过程运行，而不是采用高葡萄糖分批发酵。间歇或连续补加葡萄糖，使其残留浓度保持在菌株形成有氧乙醇的特定阈值以下。同时，维持充足的氧传递，并利用溶解氧、尾气、生物量或底物测量结果进行反馈控制，以防止碳源过量补加。
核心运行原则是控制碳流：应以高密度培养物能够通过有氧代谢消耗葡萄糖的大致速率供应葡萄糖，而不是让过量葡萄糖积累并驱动乙醇生成。
高密度酵母培养物为何会产生 Crabtree 效应
过量葡萄糖会改变代谢方向
在Saccharomyces cerevisiae中，即使氧气充足，较高的葡萄糖浓度也可能导致乙醇生成。此时，碳源会从生物量合成转向发酵代谢。
这会降低生物量产率，并可能降低氧利用效率，因为培养物不再将大部分碳源用于有氧生长。
仅靠氧气无法防止该效应
即使反应器充分通气，如果葡萄糖进入的速度超过细胞通过呼吸代谢处理葡萄糖的能力，仍可能出现 Crabtree 效应。因此，在不控制葡萄糖补料的情况下，仅提高搅拌或通气并不是可靠的解决方案。
高细胞密度会提高工艺敏感性
随着生物量浓度升高，底物总消耗速率也会增加。运行初期适用的补料速率，后期可能会变得不足；而未根据实际摄取速率确定的补料速率，则可能导致残留葡萄糖积累。
因此，高密度运行需要动态补料控制，而不仅仅是一套固定配方。
中试工厂应如何控制碳源补料
采用补料分批操作，而不是高葡萄糖分批发酵
开始时使用能够支持初始生长的葡萄糖浓度，然后通过间歇或连续补料逐步添加底物。这可以防止分批操作中常见的大量葡萄糖积累。
补料分批操作还有助于控制过高渗透压、降低水活度或直接代谢应激所导致的底物抑制。
将残留葡萄糖保持在 Crabtree 阈值以下
关键控制目标不是某个特定的补料体积，而是将残留葡萄糖浓度保持在触发有氧乙醇生成的菌株和工艺特定阈值以下。
该阈值应在开发过程中通过实验确定，因为它取决于酵母菌株、温度、生物量浓度、氧传递能力和反应器配置。
使补料速率与细胞摄取速率相匹配
补料应跟踪培养物通过有氧代谢消耗葡萄糖的能力。如果葡萄糖开始积累，应降低或暂停补料；如果培养物受到碳限制且始终保持充分氧合，则应谨慎提高补料速率。
连续补料通常可以实现更平稳的控制，而当中试工厂的自动化或分析能力有限时，间歇补料也可以发挥良好效果。
在生物量扩增过程中采用受控补料曲线
随生物量逐步增加的补料曲线，可以在不造成葡萄糖大幅波动的情况下支持高细胞密度。具体曲线应根据实测的生物量形成、底物消耗和氧需求进行验证，而不应未经调整地照搬其他规模的工艺。
将生物反应器测量结果作为运行信号
溶解氧可以揭示过量补料
溶解氧突然下降可能表明，葡萄糖补料使呼吸需求超过了反应器的氧传递能力。如果同时存在过量底物，培养物可能正在接近氧限制并转向发酵代谢。
因此，溶解氧可作为间接预警信号，但不应将其视为葡萄糖浓度的直接测量值。
尾气数据可以加强控制
尾气中二氧化碳和氧气的变化可以反映呼吸活性和摄氧量的变化。结合溶解氧和补料速率数据，尾气测量可以帮助判断培养物处于碳限制、供应充足还是补料过量状态。
直接测量葡萄糖可提高可靠性
残留葡萄糖测量可以最直接地确认补料策略是否实现了目标。在中试规模下，定期取样可能已经足够；自动分析仪则可以在高密度运行期间支持更严格的控制。
监测乙醇作为确认信号
乙醇积累表明碳源正在转向发酵代谢。乙醇是过程开发中有价值的测量指标，但操作人员应针对上游原因，即葡萄糖过量或氧传递不足，采取措施，而不是仅仅在乙醇出现后再进行处理。
维持有利于呼吸生长的条件
提供足够的氧传递能力
反应器必须能够在目标生物量浓度和补料速率下传递足够的氧气。应综合评估搅拌、通气、压力和容器设计，因为真正的限制因素是氧传递能力，而不仅仅是标称气流量。
如果氧气受到限制，即使残留葡萄糖浓度较低，也可能需要降低葡萄糖补料速率。
保持温度稳定控制
温度会影响生长速率、底物摄取、氧需求和乙醇生成。中试工厂应采用可靠的温度控制，并针对特定酵母菌株和工艺目标验证运行设定点。
补充参考资料中针对最大生长和酒精生成所给出的具体温度范围，不应推广到所有酵母生物量工艺；生物量优化和乙醇生产可能需要不同的条件。
调节 pH 并限制污染
将 pH 保持在针对菌株和工艺验证的范围内。对于许多酵母操作，将 pH 保持在 5 以下还有助于减少细菌污染，但具体设定点应根据生物体和下游要求确定。
pH 控制并不能直接抑制 Crabtree 效应，但污染或 pH 漂移会改变生长和底物消耗行为，使补料控制变得不可靠。
提供必需的氧依赖性营养物
即使目标是抑制乙醇生成，酵母仍需要氧气来完成重要的生物合成功能，包括与细胞膜相关的代谢。因此，受控氧合必须支持生长，同时避免产生过度氧化应激或失去对氧需求的控制。
谨慎考虑替代碳源
在适当情况下替代快速生长糖源
替代碳源可能会降低快速葡萄糖驱动型发酵的倾向。当工艺目标是生产生物量且生物体能够高效代谢替代碳源时，这种方法可能很有用。
然而，替代碳源并不一定优于葡萄糖补料。必须从生长速率、生物量产率、成本、下游影响和放大行为等方面对替代碳源进行评估。
不要利用替代碳源来规避过程控制
不同的碳源可以改变代谢响应，但并不能消除对底物浓度和氧传递的控制需求。任何供应速度超过培养物利用能力的碳源，都可能造成类似的不平衡或引发其他形式的抑制。
了解其中的权衡
葡萄糖过低会限制生物量生产率
通过使培养物处于饥饿状态来抑制乙醇生成并不是目标。如果补料过于保守，生物量生产率会下降，反应器可能需要更长的运行时间。
理想的运行窗口应是碳源充足但不积累，而不是葡萄糖过量或葡萄糖饥饿。
激进补料可能超过氧传递能力
提高葡萄糖补料速率可能使呼吸需求的增长速度超过中试工厂的供氧能力。即使补料策略最初有效，这也会带来氧限制和乙醇重新生成的风险。
因此，补料速率必须同时受到底物摄取能力和氧传递能力的约束。
间歇补料会造成浓度波动
脉冲补料实施起来较为简单，但每次添加都可能使葡萄糖暂时升高到目标范围以上。更小且更频繁的添加，或连续计量补料，可以实现更严格的控制。
放大会改变运行窗口
实验室反应器与中试反应器之间的混合时间、氧传递能力、热移除能力和传感器响应可能存在显著差异。在小型容器中有效的补料策略，在中试规模下可能导致局部葡萄糖或氧气波动。
因此，中试运行应验证残留葡萄糖、乙醇、溶解氧和生物量，而不应假设可以直接按几何比例放大。
如何将这些方法应用于中试工厂
采用结合补料管理、氧监测和确认性测量的分阶段控制策略。
- 如果您的主要目标是最大化生物量产率：采用葡萄糖补料分批操作，并调整补料速率，使残留葡萄糖保持在通过实验确定的 Crabtree 阈值以下。
- 如果您的主要目标是实现高细胞密度：根据生物量增长提高补料速率，但将其限制在反应器氧传递能力范围内，并密切监测溶解氧。
- 如果您的主要目标是简化中试工厂操作：采用受控间歇加料，并频繁测量葡萄糖和乙醇，然后根据观察到的响应优化脉冲大小和间隔。
- 如果您的主要目标是实现可放大的工业控制：尽可能利用残留葡萄糖开发反馈控制策略，并结合溶解氧、尾气、生物量和乙醇趋势进行辅助判断。
- 如果您的主要目标是同时避免发酵和底物抑制：用逐步补料取代高初始葡萄糖浓度，并针对所选菌株和碳源验证运行窗口。
通过受控的碳源供应和充足的氧传递，中试工厂可以使高密度酵母生长主要保持在呼吸代谢状态，从而提高生物量产率，并形成在生产规模上具有充分依据的补料策略。
总结表：
| 控制领域 | 推荐方法 | 主要目的 |
|---|---|---|
| 碳源补料 | 采用连续或间歇补料分批补料 | 防止葡萄糖积累和乙醇过量生成 |
| 残留葡萄糖 | 将浓度保持在菌株特定的 Crabtree 阈值以下 | 维持以呼吸代谢为主的生长 |
| 氧传递 | 协调搅拌、通气、压力和容器设计 | 满足高细胞密度下的呼吸需求 |
| 过程监测 | 跟踪溶解氧、尾气、生物量、葡萄糖和乙醇 | 检测过量补料、氧限制或碳限制 |
| 补料调整 | 随生物量谨慎增加；如果葡萄糖积累则降低或暂停补料 | 使供应量与细胞摄取能力相匹配 |
| 运行条件 | 控制温度、pH、污染风险和必需营养物 | 支持稳定可靠的酵母生长 |
| 放大验证 | 在中试规模下验证葡萄糖、乙醇、生物量和氧行为 | 防止放大过程中的混合和氧传递问题 |
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