在中试生物反应器中，二相生长可表现为由短暂代谢停滞分隔的两阶段生长模式。在第一阶段，细胞优先消耗葡萄糖，而葡萄糖介导的分解代谢物阻遏会抑制乳糖等替代碳源的代谢途径。葡萄糖耗尽后，cAMP水平升高，替代代谢途径被激活，培养物可能出现短暂延滞，随后恢复生长。
识别二相生长最可靠的方法，是将生物量、单独底物浓度、溶解氧、pH和生长速率进行关联分析。管理通常包括通过补料分批进料控制残余葡萄糖，或选择不会强烈触发分解代谢物阻遏的碳源和补料曲线。
二相生长如何形成
优先碳源首先被消耗
当培养基中含有葡萄糖和第二种碳源时，大肠杆菌（E. coli）等生物通常会首先消耗葡萄糖，因为葡萄糖更易被代谢。
这会产生一个生物量快速形成、底物摄取速率较高的初始阶段。在此阶段，次级碳源可能基本未被利用。
葡萄糖抑制替代代谢途径
葡萄糖的存在会使细胞内cAMP水平保持较低。因此，cAMP-CAP复合物无法充分激活包括乳糖利用所需的lac操纵子在内的替代代谢途径的转录。
葡萄糖还可能导致诱导物排阻，从而限制替代糖的摄取或有效诱导。因此，细胞不会投入资源合成当下并不需要的酶。
耗尽会产生次级延滞期
优先碳源耗尽后，细胞内cAMP水平升高。这能够激活依赖cAMP-CAP的替代代谢途径，但培养物需要一定时间来合成相关转运蛋白和酶。
结果是生长速率暂时降低或出现停滞。当次级底物代谢途径被激活后，生长恢复并形成二相生长曲线的第二阶段。
如何在中试生物反应器中观察二相生长
跟踪生物量以获得阶梯式生长曲线
在整个批次过程中，监测光密度、细胞干重或其他经过验证的生物量测量值。
二相生长通常表现为生物量初始增加、短暂平台期或生长速率降低阶段，以及培养物开始消耗替代碳源后的第二次增加。
测量各碳源的浓度
仅测定总碳水化合物浓度不足以将二相生长与一般性底物限制区分开来。应使用适当的离线或在线测量方法，分别分析葡萄糖和次级底物。
典型模式是葡萄糖快速耗尽，而次级底物消耗很少；当葡萄糖耗尽后，次级底物的摄取开始增加。
利用溶解氧作为代谢指标
优先碳源耗尽时，溶解氧通常会发生变化。在不同代谢程序转换期间，底物摄取和耗氧需求暂时下降，因此溶解氧可能升高。
当培养物重新利用次级底物生长时，耗氧需求可能再次增加。因此，应结合生物量和底物数据解读溶解氧信号，而不应将其作为单独的诊断依据。
监测pH和生长速率
酸生成、二氧化碳释放或呼吸活性的变化，可能在转换点附近引起pH变化。具体变化方向和幅度取决于生物体、培养基、缓冲能力和操作条件。
根据生物量变化趋势计算或估算生长速率。与葡萄糖耗尽同时发生的生长速率显著下降，比缺乏底物数据时单纯观察到的生长减缓，更能说明发生了二相转换。
区分二相生长与其他工艺问题
次级延滞期可能被误认为是毒性、氧限制、营养物耗尽、污染或过早结束批次。
将生长停滞的时间与残余底物浓度、溶解氧、搅拌和通气记录、pH控制活动以及其他可用工艺数据进行比较。当停滞紧接在优先碳源耗尽后发生，并随后伴随替代底物摄取时，该诊断最为可信。
分解代谢物阻遏如何影响工艺
产物形成可能受到抑制
分解代谢物阻遏不仅会影响替代糖上的生长，还可能抑制参与次级代谢物形成或重组产物生产的酶和代谢途径。
因此，如果碳源或其浓度抑制了目标途径，培养物可能获得了大量生物量，但目标产物的产量低于预期。
过量底物可能扭曲动力学
高底物浓度除了会引起分解代谢物阻遏，还可能导致底物抑制等问题。底物浓度与生长速率之间的非单调关系，可以用Andrews型表达式表示：
[ r = \frac{r_m C_A}{K_S + C_A + C_A^2/K_i} ]
其中，(r)为比生长速率，(r_m)为最大比生长速率，(C_A)为底物浓度，(K_S)为半最大生长常数，(K_i)表示抑制项。
这进一步说明必须控制底物供给，而不能假定碳源越多，生长就一定越快。
应将底物消耗与生物量联系起来
可以通过产率系数评估生物量形成与底物利用之间的关系：
[ \frac{dC_A}{dt} = -\frac{1}{y_B}\frac{dC_B}{dt} ]
这有助于操作人员将预期底物消耗量与实际观察到的生物量形成量进行比较。不匹配可能表明存在阻遏、抑制、氧限制、维持代谢或测量误差。
在中试操作中管理二相生长
采用受控补料分批进料
最直接的策略，是避免葡萄糖以能够强烈产生阻遏的浓度积累。受控补料可以在提供足够碳源以支持目标生长速率的同时，将残余葡萄糖维持在较低水平。
补料控制应基于经过验证的工艺测量值和物料衡算。目标并不是简单地最大化补料速率，而是使培养物保持在同时支持生长和产物形成的代谢状态。
防止非计划性的碳源切换
如果工艺要求持续利用优先底物生长，则应在计划的终点或转换点之前防止葡萄糖耗尽。
这需要监测残余葡萄糖，而不能仅依赖已运行时间。运行早期适用的补料速率，随着生物量和底物需求增加，可能会变得不足。
规划有意的顺序代谢
二相生长并不总是不利的。某些工艺可能有意使用葡萄糖生成生物量，再利用次级碳源进行产物生产或途径激活。
在这种情况下，应提前对转换过程进行表征，并将预期的次级延滞期纳入批次时间安排、取样计划、控制逻辑和产物产率计算。
选择非阻遏型碳源策略
在工艺生物学允许的情况下，应使用不会强烈触发分解代谢物阻遏的碳源或碳源组合。
这可以减少明显代谢转换的需求，并可能改善替代途径的表达。但仍必须根据生长速率、产物质量、底物成本、下游加工和放大行为进行评估。
建立基于传感器的转换方法
一种实用的中试工厂方法包括：
- 通过生物量测量识别生长速率变化。
- 通过单独的底物检测确认底物耗尽及随后发生的摄取。
- 通过溶解氧趋势检测耗氧需求的变化。
- 利用pH以及在条件允许时的呼吸测量，支持代谢状态解读。
- 利用补料和控制系统记录，将生物学变化与设备或操作扰动区分开来。
这种综合信号比任何单一传感器都更加可靠。
理解其中的权衡
低葡萄糖可能限制生长
维持较低的残余葡萄糖有助于减少阻遏，但过度限制可能导致碳限制并降低生物量生产率。
因此，补料量必须足以支持目标生长速率，同时避免葡萄糖积累。
补料分批控制会增加操作复杂性
补料分批策略需要准确的补料校准、可靠的泵、适当的取样，以及基于培养物需求变化作出的控制决策。
调节不当的补料可能造成碳限制与底物过量交替出现，导致生长不稳定和产物形成不一致。
替代底物可能带来新的限制
非阻遏型碳源可能支持较低的生长速率，需要额外的酶，或产生不同的代谢副产物。
应根据工艺性能数据选择策略，而不能假定避免阻遏就一定能自动改善整体工艺。
放大可能改变观察到的生长曲线
实验室设备与中试规模设备之间的混合、氧传递、补料分布和传感器响应可能存在差异。
在小型反应器中表现得很明显的转换，在中试规模下可能更加宽缓或同步性更差。因此，中试运行应验证底物浓度、局部补料输送、耗氧需求和培养物响应之间的关系。
根据目标做出正确选择
适当的策略取决于工艺目标是最大化生物量、产物形成，还是有意利用顺序底物。
- 如果您的主要目标是最大化生物量：控制优先碳源，避免葡萄糖耗尽和底物抑制，同时通过生物量和底物测量确认工艺性能。
- 如果您的主要目标是最大化重组蛋白或次级代谢物的产量：将残余葡萄糖维持在非阻遏水平，或使用经过验证的非阻遏型碳源，以保持目标途径的表达。
- 如果您的主要目标是研究二相生理现象：运行成分明确的混合底物分批培养，并在转换过程中关联分析生物量、单独底物浓度、溶解氧、pH和生长速率。
- 如果您的主要目标是中试规模的工艺控制：结合使用底物测量值和实时传感器趋势，检测转换过程，并在非计划性次级延滞期发生前调整补料。
通过关联测量和受控碳源供给，二相生长可以成为一种可测量、可管理的工艺状态，而不再是无法解释的生产率损失。
总结表：
| 工艺重点 | 关键指标 | 推荐管理措施 |
|---|---|---|
| 检测二相生长 | 生物量、葡萄糖、次级底物、溶解氧、pH、生长速率 | 将底物耗尽与短暂生长停滞及次级底物摄取恢复进行关联 |
| 降低分解代谢物阻遏 | 较低的cAMP响应、替代代谢途径受到抑制、产物形成减少 | 通过受控补料维持较低残余葡萄糖，或评估非阻遏型碳源 |
| 防止底物抑制 | 葡萄糖过量、生长速率降低、非单调动力学 | 利用经过验证的测量值和物料衡算控制补料浓度与速率 |
| 管理批次转换 | 葡萄糖耗尽、耗氧需求变化、代谢延滞 | 在补料控制、取样、时间安排和产物产率计算中规划转换过程 |
| 实现可靠放大 | 混合、氧传递、补料分布、传感器响应 | 在中试规模生物反应器中验证代谢曲线和控制性能 |
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