包涵体的形成会使下游加工更加复杂，但也可能简化初始产品捕获。 在E. coli等细菌表达系统中，高水平的重组蛋白生产可能超出宿主的折叠能力，导致目标蛋白以不溶性包涵体的形式积累。因此，在产品可用之前，中试工厂必须增加细胞破碎、包涵体回收、化学溶解、受控复性以及额外的纯化和分析操作。
包涵体使工艺从回收可溶性蛋白转变为重建功能性产品。由于致密聚集体易于分离，它们可以提高初级回收效率；但溶解和复性会对设备、工艺控制、收率管理和产品质量检测提出更高要求。
包涵体如何改变下游工艺
产品变为细胞内产物
包涵体保留在细菌细胞内，而不会释放到培养基中。因此，下游工艺流程必须从细胞收获和机械破碎开始，以释放目标物料。
在中试规模下，通常需要采用高压均质或其他稳健的裂解方法。操作设计必须在实现充分破碎的同时避免过度升温，因为过度升温可能增加聚集或加速蛋白水解降解。
细胞裂解释放额外杂质
破碎过程会将宿主细胞蛋白、核酸、膜碎片、蛋白酶和细菌内毒素与包涵体一同释放出来。与从澄清培养上清液中回收产品相比，这会带来更具挑战性的杂质去除问题。
对于拟用于治疗或注射的产品，内毒素控制尤为重要。因此，下游工艺必须包括适当的杂质清除步骤和经过验证的分析检测，不能仅依靠包涵体的物理分离。
包涵体有助于初级分离
与大部分可溶性细胞物质相比，不溶性聚集体的密度更高、溶解度更低。裂解后，可通过离心或微滤对包涵体组分进行浓缩和分离，从而去除相当一部分可溶性污染物。
这是包涵体在操作上的主要优势：早期产品富集通常较为有效。然而，回收的组分通常不具有生物活性，并且仍含有吸附或结合的宿主细胞杂质。
产品回收所需的单元操作
细胞收获和高压破碎
工艺通常从离心或其他细胞收获操作开始，随后进行高压细胞破碎。中试规模设备必须考虑进料黏度、固体负载、处理量、温度控制，以及必要时的多次处理。
裂解步骤还会影响后续的每一项操作。破碎不充分会降低回收率，而过度剪切或升温则可能增加污染物释放并损伤目标蛋白。
包涵体分离和洗涤
破碎后，通常通过离心或微滤回收不溶性包涵体物料。可以增加洗涤操作，以减少膜碎片、核酸、可溶性宿主蛋白和其他工艺污染物。
这些步骤需要对固体处理和再悬浮进行仔细控制。洗涤控制不当可能导致杂质残留，或因转移和分离过程中的产品损失而降低回收率。
化学溶解
分离出的包涵体必须转化为可溶性蛋白流。通常需要使用尿素或盐酸胍等变性剂，并结合受控的pH值；在适用情况下，还需采用还原条件，以破坏非天然相互作用和二硫键连接的聚集体。
溶解过程会增加专用容器、化学品储存、混合能力和废物处理方面的要求。同时，操作还必须避免导致目标蛋白进一步发生化学修饰或不可逆沉淀的条件。
受控复性
溶解会产生未折叠或高度变性的蛋白，因此需要进行受控复性，以恢复正确的三维结构。复性可能包括稀释、逐步去除变性剂、缓冲液置换、氧化还原控制、温度管理和蛋白浓度控制。
这通常是工艺中对收率最敏感的操作。复性反应器可能需要较大的体积和停留时间，而局部浓度梯度或混合控制不佳则可能促进再次聚集。
色谱纯化和浓缩
复性后，通常需要通过色谱将正确折叠的产品与错误折叠的组分、聚集体、残留宿主细胞蛋白、核酸、内毒素和工艺化学品分离。可根据蛋白质特性和杂质谱选择离子交换、尺寸排阻、亲和或其他色谱模式。
可能还需要进行浓缩和缓冲液置换，以便为产品配方或进一步加工做准备。整个工艺流程必须同时满足纯度要求，并围绕蛋白在接触界面、压力、pH变化和浓缩步骤中的稳定性进行设计。
分析验证
工艺成功与否不能仅以总蛋白回收量来界定。分析检测必须确认产品的身份、纯度、聚集状态、结构完整性和生物活性。
对于治疗性蛋白，质量评估可能包括宿主细胞蛋白、残留DNA、内毒素、化学残留物和其他产品特异性杂质的检测。因此，复性除了增加设备和加工负担之外，还会带来额外的分析负担。
对中试工厂设计和运行的影响
需要更多专用设备
可溶性蛋白工艺可能从细胞去除或澄清直接进入纯化步骤。而包涵体工艺则需要增加用于高压裂解、固体分离、变性剂处理、复性和废物管理的设备。
中试工厂必须配备适用的容器、泵、离心机或过滤器、传热能力，以及用于处理具有化学腐蚀性或高浓度工艺流的防护设施。
缓冲液和化学品需求更高
溶解和复性可能消耗大量尿素、盐酸胍、还原剂、缓冲液和稀释液。这些需求会影响原材料储存、溶液配制能力、厂房占地面积和废物处理负荷。
工艺还必须考虑在色谱、配方或生物应用之前对变性剂进行去除或稀释。
加工时间更长
复性及相关的缓冲液置换操作可能显著增加下游工艺的停留时间。加工时间延长会增加容器占用，并可能在多个批次共用中试工厂设备时造成排程限制。
较长的中间体储存时间还会增加对温度控制、生物负载管理和中间物流稳定性研究的需求。
总回收率面临更大风险
尽管包涵体可以带来较高的体积表达量和有价值的早期富集效果，但每增加一道操作，就会增加产品损失的机会。损失可能发生在裂解、洗涤、溶解、复性、过滤、色谱和转移过程中。
因此，具有经济意义的指标并不只是表达水平，而是完整工艺结束时回收的正确折叠、纯化且具有活性的产品量。
理解其中的权衡
主要优势：高效的早期捕获
裂解后，包涵体可以简化第一步分离，因为目标产物集中在颗粒组分中。这可能减少在初始纯化步骤中处理全部可溶性细胞物质的负担。
当包涵体具有足够高的富集程度，并且能够在不过度损失产品的情况下完成洗涤时，这一优势最为明显。
主要代价：产品重构
以包涵体形式回收时，蛋白质通常不处于具有活性的天然构象。因此，工艺必须在与聚集和错误折叠相竞争的条件下重建正确的结构。
复性具有明显的蛋白质特异性。一种重组蛋白的成功条件可能无法直接转用于另一种蛋白。
不能将内毒素视为次要杂质
细菌细胞破碎会从细胞包膜中释放脂多糖内毒素。由于内毒素可能与蛋白质及其他细胞来源物质结合，因此必须通过有针对性的工艺设计和检测加以控制。
单独使用离心或包涵体洗涤并不能证明已达到治疗级内毒素清除水平。
高表达量并不保证工艺成功
提高表达量可能增加包涵体物料的数量，同时也可能增加错误折叠、蛋白水解、聚集和杂质负荷。最佳操作点需要在表达速率、产品质量、回收率和下游处理能力之间取得平衡。
当蛋白质的生物学特性允许时，采用周质靶向或改善可溶性表达的条件等替代策略，可能降低下游工艺的复杂性。
根据目标做出正确选择
下游工艺流程应根据最终产品要求进行选择，而不应仅仅追求最高的细菌表达水平。
- 如果您的首要目标是最大化体积表达量： 当预期收益足以证明高压裂解、固体回收、溶解、复性和扩大的纯化能力投入是合理的时，可采用包涵体工艺。
- 如果您的首要目标是活性产品回收： 优先选择能够保持正确结构的表达和复性条件，并在可行时评估可溶性表达或周质表达。
- 如果您的首要目标是中试工厂的可扩展性： 应围绕增加的固体、化学品和停留时间要求，对容器、分离设备、缓冲液系统和废物处理能力进行设计和定容。
- 如果您的首要目标是治疗性产品质量： 从一开始就将内毒素、宿主细胞杂质、聚集体和结构完整性控制纳入工艺设计。
- 如果您的首要目标是成本和进度： 应将完整的下游回收率和工艺周期时间与替代宿主或表达策略进行比较，而不是只比较上游滴度。
包涵体不仅仅是表达结果；它还是一种工艺设计决策，决定了中试工厂必须如何回收、复性、纯化和验证重组蛋白。
总结表：
| 工艺领域 | 包涵体的影响 | 中试工厂要求 |
|---|---|---|
| 细胞回收 | 产品保留在细胞内 | 细胞收获和高压破碎 |
| 初级分离 | 致密聚集体有助于早期富集 | 配合受控洗涤的离心或微滤 |
| 溶解 | 聚集体需要变性剂和受控化学条件 | 专用容器、化学品处理和废物处理 |
| 复性 | 未折叠蛋白必须恢复其活性结构 | 受控稀释、缓冲液置换、氧化还原、温度和混合 |
| 纯化 | 必须去除错误折叠蛋白、聚集体、内毒素和宿主细胞杂质 | 色谱、浓缩和缓冲液置换 |
| 质量控制 | 回收率本身不能确认产品质量 | 检测身份、纯度、活性、聚集状态、内毒素、残留DNA和宿主细胞蛋白 |
| 设施影响 | 更多操作会增加时间、化学品、设备需求和产品损失风险 | 为固体、缓冲液、中间体储存时间、温度控制和排程提供充足能力 |
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