在启动阶段，过度的气体喷射会通过从培养基中带走溶解的二氧化碳（CO2），且其速度超过低密度细胞补充该气体的速度，从而阻碍微生物生长。 虽然喷射通常用于提供氧气，但由此导致的CO2耗竭会限制异养型CO2固定。这剥夺了细胞补充关键三羧酸（TCA）循环中间产物所需的碳，从而延长了停滞期并减缓了生物量的积累。
在启动期间，喷射必须在提供充足氧气的同时，避免以超过培养物产生和利用的速度移除溶解的CO2。在低细胞密度下，保持适当的CO2平衡与维持氧气传递同样重要。
为什么启动条件特别敏感
低细胞密度限制了CO2的产生
新接种的培养物中细胞相对较少，因此其总呼吸活性较低。结果，培养物在初始生长期内产生和积累的胞内及溶解CO2很少。
因此，高气体流量从液体中移除CO2的速度可能超过了微生物产生CO2的速度。在批次后期可能合适的喷射速率，在启动阶段可能就显得过高了。
溶解的CO2是中心代谢的一部分
异养微生物利用CO2固定反应来补充从TCA循环中消耗的中间产物。这些反应支持形成氨基酸生物合成和其他细胞过程所需的化合物。
诸如丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及相关羧化酶等酶，将CO2整合到代谢中间产物中。草酰乙酸的补充尤为重要，因为TCA循环中间产物不断被分流用于生物合成反应。
CO2限制会抑制生长
当溶解的CO2变得过于稀缺时，回补反应（anaplerotic reactions）无法以所需速率进行。TCA循环随后难以维持能量代谢和生物合成所需的中间产物。
在这种情况下，CO2固定成为生长的限速步骤。细胞可能保持存活，但其生长速率下降，启动停滞期变长。
喷射的权衡
氧气传递仍然必要
微生物培养物也需要氧气进行有氧呼吸，而氧气在水性介质中的溶解度相对较低。气液传质不足会导致溶解氧耗竭并造成代谢限制。
因此，喷射和搅拌是维持氧气传递的必要手段。操作挑战在于如何在不必要地带走CO2的情况下实现充足的氧气供应。
传质影响两种气体
气流并不会选择性地只将氧气传递到培养物中。根据气体成分、流速、压力和反应器条件，它也可能促进溶解CO2的移除。
这产生了一个双向的传质问题：增加喷射可能会改善氧气供应，同时减少溶解的CO2。启动控制必须考虑到这两种影响。
正确的速率随时间变化
随着细胞密度的增加，呼吸和CO2的产生也会增加。对于初始接种物来说过于激进的气体流量，一旦培养物活跃生长，可能就会变得合理。
因此，喷射应被视为一个随时间变化的运行参数，而不是在整个过程中使用的固定设置。
生长限制是如何发展的
过度喷射造成CO2失衡
其过程很简单：
- 低密度培养物产生的CO2很少。
- 高气体流量从培养基中带走了溶解的CO2。
- 溶解的CO2浓度降至有效固定所需的水平以下。
- TCA循环补充受到限制。
- 生物合成和生物量形成减慢。
结果是延长的停滞期或比预期更慢的早期生长。
这种影响是代谢性的，不一定是破坏性的
CO2剥离并不一定会杀死培养物或造成明显的细胞损伤。在这种情况下，其主要影响是造成一种代谢限制，阻止细胞有效地将可用营养物质转化为新的生物量。
这种区别在故障排除时很重要。培养物看起来可能很健康，但由于从培养基中移除了必要的代谢输入，其生长速度依然缓慢。
理解权衡
喷射过少会导致氧气限制
在不考虑氧气需求的情况下降低气体速率可能会产生另一个问题。随着种群的增长，氧气传递不足可能导致局部溶解氧耗竭、代谢改变或出现不想要的厌氧区域。
过度喷射可能浪费气体和工艺能力
高气体流量可能会消耗比必要更多的工艺气体，并可能增加泡沫、废气处理需求或控制不稳定性。这些影响可能会使中试装置的操作复杂化，而不会改善早期培养表现。
然而，启动期间的主要担忧是生物学后果：在培养物产生足够的呼吸活性来补充之前，过度移除溶解的CO2。
其他传质压力可能与CO2限制混淆
生长不良也可能源于氧气传递不足、过度搅拌、剪切应力、营养失衡或温度和pH值偏差。因此，应结合溶解氧、废气CO2、搅拌和培养生长数据来评估高喷射量。
单一症状（如延长的停滞期）并不能证明CO2剥离是唯一原因。操作数据应确定培养物是处于氧气限制、CO2限制还是受其他参数影响。
如何将其应用于中试装置
启动操作应平衡氧气传递与培养物产生和保留可用CO2的能力。
- 如果您的主要重点是快速接种物扩增： 从适合低初始生物量的保守喷射速率开始，然后随着氧气需求和CO2产量的增加而增加。
- 如果您的主要重点是可靠的放大： 同时监测溶解氧、废气CO2、气体流量和生长情况，以确保喷射的变化不会以牺牲二氧化碳可用性为代价来优化氧气传递。
- 如果您的主要重点是防止延长的停滞期： 避免以超过早期培养物产生速度的速度带走溶解的CO2，并在适当情况下评估受控的CO2补充或顶空条件。
- 如果您的主要重点是诊断生长异常缓慢的原因： 检查是否存在CO2耗竭的证据，同时考虑氧气限制、pH漂移、营养短缺和过度剪切等常见原因。
有效的启动喷射可以在氧气供应和溶解CO2可用性之间保持平衡，使培养物能够在其生物学允许的范围内尽快建立健康的生长。
总结表：
| 关键因素 | 对启动生长的影响 | 推荐方法 |
|---|---|---|
| 低细胞密度 | CO2产量有限，使培养物易受CO2剥离影响。 | 从保守的气体流量开始。 |
| 过度喷射 | 移除溶解CO2的速度超过细胞补充速度。 | 随着生物量和氧气需求的增加，逐渐增加喷射量。 |
| CO2耗竭 | 限制回补反应和TCA循环补充。 | 监测废气CO2，并在适当情况下考虑受控的CO2补充。 |
| 喷射不足 | 可能导致氧气限制、代谢改变或厌氧区。 | 维持满足氧气需求的最低传质强度。 |
| 其他工艺压力 | 搅拌、剪切、pH、温度或营养物质也可能导致生长缓慢。 | 综合评估溶解氧、废气数据和培养生长趋势。 |
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