当细胞聚集体生长超过氧气在被消耗前能够渗透的距离时，氧扩散限制就会变得关键。在球形聚集体中，由于细胞持续呼吸，氧浓度会从表面向中心逐渐降低。当聚集体半径超过临界值时，中心会变得缺氧或无氧，从而导致代谢应激、生长减缓、功能改变，并可能造成细胞死亡。
临界团簇尺寸是指计算得到的中心氧浓度达到零或某一设定存活率阈值时的半径。该尺寸可以通过稳态扩散-反应模型进行估算，并利用聚集体中的氧浓度或存活率测量进行实验验证。
为什么聚集体内部会受到氧限制
细胞在整个团簇中消耗氧气
氧气必须先从气相转移到液相，然后从液相转移到聚集体表面，最后扩散通过细胞密集的内部区域。
由于氧气在水性培养基中的溶解度较低，高细胞密度和快速呼吸可能会使氧气的消耗速度超过其在聚集体中心的补充速度。
中心区域受到的限制最大
对于表面氧浓度为（C_s）的球形聚集体，氧浓度会向内朝中心逐渐降低。中心是距离含氧液体最远的点，并且被最多的耗氧生物量包围。
这会形成径向氧梯度：
- 外部区域：含氧，通常具有活性。
- 中间区域：受到氧限制并处于代谢应激状态。
- 核心区域：当聚集体过大时，严重缺氧或无氧。
对细胞和工艺性能的影响
氧限制可能导致：
- 有氧代谢和生长减缓。
- 分化或产物形成发生变化。
- 代谢应激积累。
- 中心区域坏死或失去活性。
- 球状体或聚集体培养批次间的变异性增大。
在中试规模下，高生物量浓度、培养液黏度增加、搅拌不足或曝气不足导致的整体供氧不良，可能会进一步放大这一问题。
球形聚集体中的氧渗透建模
稳态扩散-反应平衡
对于半径为（r_0）的球形聚集体，假设：
- 氧浓度处于稳态。
- 聚集体内部的有效扩散系数（D）恒定。
- 氧摄取均匀。
- 球形几何结构。
- 聚集体内部不产生氧气。
- 聚集体表面具有指定的氧浓度（C_s）。
如果将细胞氧摄取近似为零级速率（q），则控制方程为：
[ D\left[\frac{1}{r^2}\frac{d}{dr}\left(r^2\frac{dC}{dr}\right)\right]-q=0 ]
边界条件为：
[ \left.\frac{dC}{dr}\right|_{r=0}=0 ]
以及
[ C(r_0)=C_s ]
第一个条件反映了中心处的对称性：在（r=0）处，氧通量没有优先方向。
氧浓度分布
得到的氧浓度分布为：
[ C(r)=C_s-\frac{q}{6D}\left(r_0^2-r^2\right) ]
在中心处：
[ C(0)=C_s-\frac{q r_0^2}{6D} ]
该方程显示了关键关系：中心氧浓度随聚集体半径的平方增加而降低，并随表面氧浓度和扩散系数的增加而升高。
估算临界半径
将中心浓度设为零，即可得到理想化的临界半径：
[ C(0)=0 ]
因此：
[ r_c=\sqrt{\frac{6DC_s}{q}} ]
如果（r_0<r_c），模型预测氧气能够在整个聚集体中保持可用。
如果（r_0>r_c），计算得到的中心浓度将变为负值。在物理上，氧浓度不可能为负；相反，聚集体核心会形成缺氧或无氧区域。
定义更具实践意义的临界团簇尺寸
使用存活率阈值，而不仅仅是零氧浓度
零氧浓度标准有助于确定无氧状态的开始，但许多细胞在氧浓度降至零之前就会受到应激。
更具实践意义的阈值是最低可接受中心浓度（C_{\min}），代表存活率、生产力或表型要求：
[ C(0)=C_{\min} ]
相应的允许半径为：
[ r_{\text{crit}}= \sqrt{\frac{6D(C_s-C_{\min})}{q}} ]
该定义通常更适用于中试工厂运行，因为工艺目标不仅是避免无氧，还要在整个聚集体中维持可接受的细胞性能。
区分半径和直径
方程使用的是半径，而聚集体测量结果通常以直径报告。
因此：
[ d_{\text{crit}}=2r_{\text{crit}} ]
混淆半径和直径会导致报告的临界尺寸出现两倍误差。
如何在中试工厂确定临界尺寸
测量控制内部氧传输的参数
计算需要估算以下参数：
- 有效扩散系数（D）：聚集体内部的氧扩散系数，包括细胞堆积和细胞外基质的影响。
- 表面氧浓度（C_s）：聚集体边界处的氧浓度。
- 比氧摄取率或体积氧摄取率（q）：相关培养条件下聚集体的耗氧速率。
- 最低可接受浓度（C_{\min}）：与可接受存活率或功能相关的浓度。
这些数值应在具有代表性的温度、培养基、细胞密度和生理条件下获得。
考虑整体供氧传递
聚集体表面浓度不一定等于生物反应器控制器设定的整体溶解氧浓度。
由于氧气在进入聚集体之前必须穿过外部液膜，因此可能存在浓度差。因此，应将反应器层面的氧传递和聚集体层面的扩散视为相互关联的阻力。
中试工厂应对以下因素进行表征或控制：
- 搅拌强度。
- 曝气速率和气泡分布。
- 体积氧传递系数（k_La）。
- 溶解氧设定值。
- 气体组成和操作压力。
- 培养液黏度和生物量浓度。
增加搅拌、改善曝气或在升高的压力下运行，可以提高聚集体表面的氧供应。然而，如果团簇本身过大，这些措施并不能消除内部扩散限制。
将模型预测与测量结果进行比较
实际确定过程应结合计算和观察：
- 测量聚集体尺寸分布随时间的变化。
- 在具有代表性的培养条件下估算氧摄取量。
- 估算或测量有效氧扩散系数。
- 确定表面或整体溶解氧条件。
- 计算预测的中心浓度和临界半径。
- 测量内部氧浓度、存活率或代谢活性。
- 将观察到的核心应激开始时间与模型预测结果进行比较。
氧敏感探针、荧光氧指示剂、微电极和空间存活率染色有助于揭示预测的缺氧核心是否确实正在形成。
开展尺寸依赖性实验
在尽可能保持其他条件不变的情况下，可以在一系列聚集体尺寸范围内运行或取样培养物。
将中心氧浓度、存活率或生产力与聚集体半径进行关联，有助于确定性能开始下降的尺寸。随后，可以将这一经验阈值与扩散-反应估算结果进行比较。
哪些因素控制临界团簇尺寸？
提高表面氧浓度
更高的（C_s）会增加聚集体可获得的氧量，并提高预测的临界半径。
在实践中，这可能涉及提高溶解氧设定值、富氧、改善气液传质或提高反应器压力。如果氧气向液体中的传递成为主要瓶颈，其收益将受到限制。
提高有效扩散系数
更大的（D）可以使氧气更快地渗透通过聚集体。
聚集体压实、致密的细胞外基质和降低的内部孔隙率都会降低有效扩散系数。因此，控制细胞聚集和基质结构可能与改变反应器搅拌同样重要。
降低氧摄取速率
较低的（q）会提高允许的团簇尺寸。
受控补料可以调节生物量增长和呼吸需求。补料分批运行还有助于防止黏度和生物量过度累积，从而避免反应器整体（k_La）降低。
控制聚集体尺寸
最直接的策略是将聚集体半径保持在计算或实验验证的临界值以下。
在实践中，这可以通过管理接种密度、搅拌、培养时间、载体几何结构或聚集体解聚来实现。较小的载体或较薄的活性细胞层可以缩短扩散距离，并帮助维持更高比例的活细胞。
了解其中的权衡
更高的搅拌并非通用解决方案
搅拌可以改善整体供氧传递并减少液体中的浓度梯度，但过度搅拌可能会损伤脆弱的聚集体或对剪切敏感的细胞。
搅拌还可能改变聚集体的尺寸和形态，使得难以将生物学响应与流体动力学响应区分开来。
更高的溶解氧可能带来生物学代价
提高氧供应可能有助于防止缺氧，但在对氧敏感的系统中，较高的氧条件可能改变细胞行为或增加氧化应激。
因此，目标应是维持充足的氧浓度范围，而不是达到尽可能高的溶解氧浓度。
零级模型是一种近似
零级模型假设只要存在氧气，任何位置的氧摄取速率都保持恒定。实际细胞的氧摄取通常取决于局部氧浓度，在低氧条件下往往接近一级动力学行为。
因此，简单的临界半径方程最适合作为筛选和设计工具。当低氧动力学、代谢变化或显著的空间异质性十分重要时，可能需要使用一级或Monod型摄取模型。
稳态可能无法描述每一个聚集体
聚集体可能会随时间生长、压实、碎裂或改变其代谢状态。
当聚集体尺寸快速变化，或在混合和放大过程中氧暴露显著变化时，可能需要采用瞬态模型。
整体溶解氧并不能证明内部氧气充足
生物反应器可能显示控制器读数处于可接受范围，而聚集体中心仍然受到氧限制。
整体测量值描述的是探头所在位置的液体状况，并不能直接测量细胞团簇内部的氧浓度。
如何将其应用于您的中试工厂
最可靠的方法是将扩散-反应估算与中试规模的氧传递和存活率测量相结合。
- 如果您主要关注无氧开始的预测：使用（r_c=\sqrt{6DC_s/q}）作为初步估算，并确定聚集体中心达到零氧浓度的时间点。
- 如果您主要关注维持细胞存活率：将零氧浓度替换为根据生物学定义的（C_{\min}），并根据（r_{\text{crit}}=\sqrt{6D(C_s-C_{\min})/q}）计算最大允许半径。
- 如果您主要关注反应器运行：测量或估算（k_La），控制搅拌和曝气，并验证整体氧传递能够维持所需的聚集体表面浓度。
- 如果您主要关注放大：跟踪聚集体尺寸分布、黏度、氧摄取量和内部存活率，而不是仅依赖溶解氧设定值。
- 如果您主要关注设计优化：比较较小载体或较薄细胞层与更高氧设定值和搅拌强度的效果，同时检查剪切损伤和氧化应激。
将聚集体尺寸、细胞氧摄取、内部扩散系数和反应器供氧传递视为一个耦合系统，中试工厂就能够确定运行边界，从而同时保护细胞存活率和工艺性能。
总结表：
| 关键因素 | 对聚集体或工艺的影响 | 实际控制措施 |
|---|---|---|
| 聚集体半径 | 更大的团簇会形成更陡峭的氧梯度和无氧核心 | 控制聚集、培养时间、搅拌或解聚 |
| 表面氧浓度（$C_s$） | 更高的氧供应量会增加临界半径 | 优化溶解氧、气体组成、压力和$k_La$ |
| 有效扩散系数（$D$） | 较低的扩散系数会限制氧渗透 | 管理压实程度、细胞外基质和孔隙率 |
| 氧摄取速率（$q$） | 更高的呼吸速率会降低中心氧浓度 | 控制生物量增长、补料和培养条件 |
| 临界半径 | 对于中心氧浓度为零的情况，可通过$r_c=\sqrt{6DC_s/q}$估算 | 将其作为初步筛选估算值 |
| 存活率阈值 | 实际限制可使用$r_{crit}=\sqrt{6D(C_s-C_{min})/q}$ | 根据存活率、生产力或表型数据定义$C_{min}$ |
| 中试验证 | 确认模型中的氧限制是否与生物学性能相符 | 测量聚集体尺寸、氧浓度、存活率和代谢活性 |
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